Ошибки преаналитического этапа пцр

Преаналитический этап

Зарубежная практика
показывает, что важнейшим условием
успешного лабораторного обследования
пациентов и снижения количества
лабораторных ошибок является стандартизация
деятельности лаборатории и, прежде
всего, процедур преаналитического
этапа. Стандартизация предполагает
разработку инструкций по операциям,
использование которых на всех этапах
ПЦР-анализа позволяет свести к минимуму
вероятность возникновения ошибок.

Разработка инструкций
на преаналитическом этапе должна
включать следующие разделы работы:

1. Показания для назначения
   врачом необходимых анализов.

2. Подготовка пациента
   к обследованию.

3. Взятие биологического
   материала в процедурном или смотровом
   кабинете (правильно выбранная стратегия
   забора материала обеспечивает
   эффективность ПЦР-диагностики).

4. Маркировка пробы и
   заполнение направления.

5. Условия транспортировки
   проб в лабораторию, сроки их доставки.

6. Температурный режим
   и продолжительность хранения материала.

7. Регистрацию направлений
   и материала.

8. Порядок сортировки
   проб в лаборатории.

Существуют два вида
ошибок на преаналитическом этапе при
проведении ПЦР-анализа, которые ведут
к неправильной постановке диагноза:
ложноположительные и ложноотрицательные.

Ложноположительные
результаты на преаналитическом этапе
(положительный результат при отсутствии
возбудителя в пробе) возникают в случаях:

• контаминации
  (загрязнения) как в отдельных пробах,
  так и во всех пробах (тотальная
  контаминация). Она возникает при
  использовании инструментария, пробирок,
  перчаток и др. материалов, загрязненных
  искомыми микроорганизмами, чужой ДНК
  или ее копиями через предметы и реагенты.
  В результате обнаруживается
  «несуществующая» инфекция. Для ее
  устранения следует использовать
  одноразовый инструментарий;

• неправильной тактики
  обследования пациента. Выявление
  микроорганизмов, не имеющих диагностического
  значения, которые могут присутствовать
  у здорового человека. Например, Neisseria
  ssp. в норме может существовать в полости
  рта и на других слизистых. Для уреаплазм,
  гарднерелл и других возбудителей
  значение имеют их количественные
  характеристики.

Рис. 9.
Формализованный бланк направления,

включающий анализы
методом ПЦР.

Ложноотрицательные
результаты на преаналитическом этапе
(отрицательный результат при наличии
возбудителя в пробе) возникают в случаях:

• неинформированности
  медицинского персонала по правильности
  забора клинического материала. Взятие
  материала должен осуществлять
  квалифицированный специалист. Перед
  началом работы следует ознакомиться
  с «Методическими рекомендациями по
  взятию, транспортировке, хранению и
  пробоподготовке биологического
  материала для ПЦР-диагностики»;

• неосмысленного выбора
  биологического материала для
  ПЦР-исследования. Например, ДНК некоторых
  возбудителей неинформативно выявлять
  в крови (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonor­hoeae),
  осуществлять забор материала в период
  ремиссии (для инфекций, протекающих с
  периодами обострений и ремиссий) и
  т.д.;

• загрязнения пробы
  примесями, ингибирующими ПЦР. Гепарин,
  продукты гемолиза эритроцитов и
  некоторые препараты для местного
  лечения способны ингибировать (тормозить)
  реакцию ПЦР. Поэтому забор материала
  должен проводиться до лечебных
  манипуляций;

• разрушения ДНК во
  время неправильной транспортировки и
  хранения пробы. Например, цельную кровь
  нельзя замораживать;

• взятия неинформативного
  мазка (недостаточное содержание в мазке
  эпителиальных клеток или содержание
  большого количества неинформативной
  слизи).

Использование
лабораторной информационной системы
(ЛИС) позволяет существенно уменьшить
процент ошибок. Целесообразно
автоматизировать процесс обработки
направлений. Это можно сделать,
формализовав направления и используя
сканер для ввода информации в ЛИС.
Немаловажную роль играет форма
бланка-заявки на исследование, которая
должна упрощать работу клиницистов,
медсестер и лабораторных регистраторов.
При регистрации в лаборатории правильно
заполненная форма заявки считывается
специальным сканером, и перечень
назначенных врачом анализов автоматически
переносится в лабораторную информационную
систему, формируя заявку на исследования.
На рисунке 9 представлена форма бланка
ИОККДЦ, где для анализов методом ПЦР
предусмотрены ячейки для заполнения
(направляемый тип биологического
материала).

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Актуальность

Часто у лечащего врача возникают претензии  к лабораторным анализам, т. е. происходит не совпадение клинической картины с лабораторными показателями. Нарушение преаналитики является одной из самых частых причин этой проблемы. Данная статья поможет разобраться с этой нелепой, но весьма серьезной задачей.

Что такое преаналитика? Преаналитика – это все процедуры, выполняемые до начала проведения лабораторных исследований, которые непосредственно влияют на результат лабораторного анализа.

Оптимально проведенная преаналитическая подготовка является основным условием точной и полной лабораторной диагностики.

Зачем нужно врачам знать преаналитику? При нарушении преаналитического этапа врачи собственноручно готовят предпосылки для заведомо ложных результатов лабораторного анализа.

Статистика

Затраты времени на этапах лабораторного исследования:

Преаналитическии этап вне лаборатории – 20,20%

Преаналитическии этап в лаборатории – 37,10%

Аналитическии этап – 25,10%

Постаналитическии этап – 13,60%

Отправка результатов – 4%

Анализ ошибок показывает, что около 40% ошибок совершается на преаналитическом этапе при выполнении исследований в плановом порядке и около 60% ошибок происходит на преаналитическом этапе при неотложных анализах. (M.Plebani, P.Carraro, 1997).

Из чего состоит преналитическии этап вне лаборатории?

— Назначение анализов

— Подготовка пациента (психологическая и физическая)

— Заполнение направления.

— Взятие биоматериала.

— Хранение и доставка биоматериала.

На каждом из выше указанных составных может быть допущена ошибка.

Общие правила при подготовке к исследованию крови:

1. Кровь сдается в утренние часы натощак (или в дневные и вечерние часы, спустя 4-5 часов после последнего приема пищи). За 1-2 дня до исследования исключить из рациона продукты с высоким содержанием жиров.

2. Показатели крови могут существенно меняться в течение дня, поэтому рекомендуется все анализы сдавать в утренние часы.

3. Накануне исследования (в течение 24 часов) исключить алкоголь, интенсивные физические нагрузки, прием лекарственных препаратов (по согласованию с врачом).

4. За 1-2 часа до сдачи крови воздержаться от курения, не употреблять сок, чай, кофе, можно пить негазированную воду. Исключить физическое напряжение (бег, быстрый подъем по лестнице), эмоциональное возбуждение. За 15 минут до сдачи крови рекомендуется отдохнуть, успокоиться.

5. Не следует сдавать кровь для лабораторного исследования сразу после физиотерапевтических процедур, инструментального обследования, рентгенологического и ультразвукового исследований, массажа и других медицинских процедур.

6. При контроле лабораторных показателей в динамике рекомендуется проводить повторные исследования в одинаковых условиях – в одной лаборатории, сдавать кровь в одинаковое время суток и пр.

7. Кровь для исследований нужно сдавать до начала приема лекарственных препаратов или не ранее, чем через 10 — 14 дней после их отмены. Для оценки контроля эффективности лечения любыми препаратами нужно проводить исследование спустя 7 – 14 дней после последнего приема препарата. Если Вы принимаете лекарства, обязательно предупредите об этом лечащего врача.

Общие правила применимы ко всем анализам, но для некоторых исследований требуется специальная подготовка и дополнительные ограничения.

Влияние некоторых факторов на результат анализов.

Психический стресс

Степень влияния психического стресса (страх перед взятием крови, предоперационный стресс и т.д.) на лабораторные результаты часто недооценивается. Между тем, под его влиянием может наблюдаться увеличение секреции гормонов (альдостерона, ангиотензина, катехоламинов, кортизола, пролактина, ренина, соматотропина, ТСГ, вазопрессина) и повышение концентрации альбумина, фибриногена, глюкозы, инсулина, лактата и холестерина.

Наложение жгута

Что происходит, когда жгут накладывается на весь период времени при взятии пробы? При использовании давления ниже уровня систолического, внутри капилляров поддерживается эффективное фильтрационное давление. Как следствие, жидкость и низкомолекулярные соединения перемещаются из внутрисосудистого пространства в интерстициальное. Макромолекулы, вещества, связанные с белками и клетки крови не проникают через стенку капилляров, таким образом, их концентрация заметно возрастает, тогда как концентрации низкомолекулярных веществ не изменяются.

Длительность наложения жгута и изменения уровней исследуемых параметров

Сравнение: через 1 мин. через 3 мин.

Параметры                                                           Отклонение в %

Билирубин                                                            +8

Холестерин                                           +5

Креатинин                                                            -9

Креатинкиназа                                    -4

Железо                                                  +7

Глюкоза                                                -9

γ-Глютамилтрансфераза     -10

Калий                                                    +5

Положение тела

Изменение положения тела – из горизонтального в вертикальное – приводит к увеличению уровня ряда показателей.

Параметры                                                                           Увеличение в %

Гематокрит                                                          13

Эритроциты                                                         15

Холестерин высокой плотности         10

Альдостерон                                                        15

Ренин                                                                    60

Взятие пробы из катетера

Если пробы берут из венозных или артериальных инфузионных катетеров, канюлю следует промыть изотоническим солевым раствором в объеме, соизмеримом с объемом катетера. Прежде чем взять пробу, выбросить первые 5 мл крови, полученной из катетера. Взятиепроб для исследований свертывающей системы из катетеров, обработанных гепарином, неприемлемо. Для гепарин-зависимых методов (тромбиновое время, АЧТВ) рекомендуется

предварительно отбросить объем крови, вдвое превышающий объем катетера; первая порция взятой затем крови может быть использована для выполнения исследований, не относящихся к системе гемостаза; последующая порция цитратной крови может использоваться только для определения нечувствительных к присутствию гепарина аналитов: протромбинового времени, рептилазного времени, фибриногена по Clauss, АТ III, мономеров фибрина. Важно, чтобы перед взятием крови в пробирку с раствором цитрата натрия не было длительной паузы, в течение которой кровь в катетере может «застаиваться».

Высота над уровнем моря

Содержание некоторых компонентов крови подвержено значительным изменениям в зависимости от высоты над уровнем моря. С увеличением высоты значительное повышение наблюдается в отношении, например реактивного белка (до 65% на высоте 3600 м), гематокрита и гемоглобина (до 8% на высоте 1400 м) и мочевой кислоты. Адаптация к высоте занимает недели, а возвращение к значениям на уровне моря происходит в течение нескольких дней. Значительное снижение величин с ростом высоты над уровнем моря обнаружено в отношении мочевого креатинина, клиренса креатинина, эстриола (до 50% на высоте 4200 м), осмоляльности сыворотки, ренина плазмы и трансферрина сыворотки.

Согласно данным ВОЗ, удельный вес лабораторных анализов составляет 75–80 % от общего числа диагностических исследований, выполняемых в медорганизациях.

Служба значительно эволюционировала: если раньше лаборатория была придатком в поиске факторов риска, постановке диагноза, назначении лечения, то сегодня она является объединяющим механизмом на всех этапах взаимодействия врача и пациента. Централизация лабораторных исследований — мировая тенденция реформирования клинической лабдиагностики. Особое значение имеет преаналитический этап клинических лабораторных исследований.

Лабораторная диагностика

Важная составляющая

Основной целью централизации лабораторных исследований является повышение эффективности лечебно-диагностического процесса за счет расширения объема лабораторной, диагностически значимой информации, которая поступает лечащим врачам из централизованной лаборатории.

Согласно постановлению коллегии Минздрава от 25.07.2018 № 14.4 «О совершенствовании работы службы лабораторной диагностики», централизация лабораторий, направленная на увеличение доступности лабораторных исследований, определена основным стратегическим моментом развития службы клинической лабораторной диагностики страны.

Важнейшей составляющей централизации является процесс взаимодействия с внешним заказчиком (медучреждением) на преаналитическом этапе оказания лабораторных услуг. Преаналитический этап включает прием пациента врачом, назначение лабораторных исследований, заполнение бланка направления, получение пациентом инструкций об особенностях подготовки к сдаче анализов или сбору биологического материала, взятие проб, доставку материала в лабораторию.

При централизации для лаборатории существенно увеличивается число пунктов сбора проб биологического материала, значительно расширяется спектр заказываемых тестов, изменяется структура проб биологического материала, ритм и временной период их поступления в лабораторию.

Взаимодействие централизованной лаборатории с заказчиком на преаналитическом этапе предполагает обучение врачей, медсестер, курьеров, обеспечение их инструкциями по подготовке пациентов к лабораторным исследованиям, правилам взятия, сбора и подготовки проб к транспортировке, организацию логистики доставки. Порядок организации взятия проб биологического материала и доставки его в централизованную лабораторию является одним из важнейших моментов обеспечения правильного взаимодействия лаборатории и учреждения здравоохранения.

Централизация лабораторных исследований предусматривает особые требования к организации преаналитического этапа, строгое выполнение которых позволит обеспечить получение качественных результатов. Любые неточности на этапе назначения лабораторных исследований будут существенным образом снижать эффективность лечебно-диагностического процесса.

Большинство ошибок в процессе лабораторного анализа — от назначения теста до интерпретации результатов — происходит до того, как образец попал в лабораторию, т. е. вне прямого контроля лаборатории. По данным различных исследований, на преаналитический этап приходится от 46 % до 68 % всех лабораторных ошибок.

Наиболее частые ошибки преаналитического этапа:

• отсутствие образца или перечня назначенных исследований;
• ошибки идентификации образца (этикетка,сопроводительный документ);
• гемолиз in vitro (в пробирке);
• сгустки в образце крови/плазмы;
• неправильная пробирка/контейнер;
• недостаточное количество образца (объем пробы);
• неправильное соотношение кровь/антикоагулянт;
• недостаточное перемешивание образца после взятия;
• неадекватные условия хранения и транспортировки;
• неправильный режим центрифугирования (время/скорость).

Рекомендации

При определении приемлемости выявленных ошибок рекомендуется использовать целевые уровни индикаторов качества преаналитического этапа, установленные Международной федерацией клинической химии и лабораторной медицины (IFCC). Ошибки преаналитического этапа могут существенно исказить состав или свойства биологического материала и таким образом существенно снизить диагностическую ценность результата лабораторного исследования. Частота таких ошибок зависит от уровня технологической дисциплины в направляющей организации здравоохранения, качества администрирования этого этапа.

Основные причины большого количества ошибок:

• отсутствие стандартов качества выполнения процедур преаналитического этапа;
• неиспользование для взятия и сбора биоматериала одноразовых безопасных приспособлений по причине существующего ложного представления об их высокой стоимости;
• недостаточные знания и качество обучения среднего медперсонала правилам и технике выполнения процедур преаналитического этапа.

Прогресс лабораторных технологий, оснащение медицинской лаборатории современными автоматическими анализаторами позволили получать существенно более точные результаты анализов. Новые автоматические анализаторы весьма чувствительны к качеству исследуемого биоматериала, что предъявляет более высокие требования к условиям взятия, хранения и срокам доставки проб.

---

Согласно приказу Минздрава от 18.04.2019 № 466 «О совершенствовании деятельности службы лабораторной диагностики Республики Беларусь», обеспечение качества преаналитического этапа лабораторных исследований является зоной ответственности клинических специалистов. В стандарте СТБ ISO 15189-2015 «Медицинские лаборатории. Требования к качеству и компетенции» требуется установление индикаторов качества с целью мониторинга и оценки работы по всем критическим аспектам преаналитического этапа. Их внедрение в лабораторную практику и систематический сбор данных позволят обеспечить надежность результатов лабораторного тестирования.

---

Внутренний стандарт

Клинико-диагностическая лаборатория (КДЛ) РНПЦ РМиЭЧ является многопрофильной, с 2016 года выполняет централизованные исследования для взрослых и детей Новобелицкого и Советского районов Гомеля. Заказчиками являются 10 поликлиник. Исследования включают широкий спектр биохимических (специфических белков и метаболитов), иммунохимических (гормоны, онкомаркеры, витамины и др.), коагулологических (коагулограмма, агрегатограмма, факторы свертывания и антикоагулянты, D-димеры и др.) лабораторных тестов.

Разработан внутренний стандарт, который был включен в текст совместного приказа РНПЦ РМиЭЧ и ГУЗО Гомельского облисполкома (№ 117 и № 167 от 05.02.2019) «О централизации лабораторных исследований». Определена схема проведения централизованных лабораторных исследований.

Для обеспечения доступности для врачей-клиницистов информации о полном спектре выполняемых тестов сотрудниками лаборатории разработаны бланки направлений.

Для обеспечения контроля качества выполнения централизованных исследований лаборатория постоянно анализирует результаты применения основных индикаторов качества преаналитического этапа:

• ошибки идентификации и транскрипции тестов;
• несоответствие направления установленной форме;
• неверный тип, недостаточный объем образца;
• повреждение образца/направления в ходе транспортировки;
• образец, направление для образца не получены;
• сгусток в образце.

По результатам анализа, проведенного КДЛ РНПЦ РМиЭЧ, несоответствия в целом выявляются для 1,3 % доставленных образцов сыворотки/плазмы. Среди индикаторов с наибольшей частотой встречаются ошибки транскрипции тестов, составляющие 1 %:

• отсутствие отметок о необходимых тестах;
• нечеткий запрос на исследование;
• незаполненные/не полностью заполненные паспортные данные пациента (не обозначен пол, возраст, не указан диагноз, отсутствует печать врача).

Реже определяются ошибки идентификации пробы — нарушение маркировки, в т. ч. расхождения между нумерацией направления и пробы. В 0,34 % случаев пробы не доставлялись в лабораторию, в 0,3 % — для проб отсутствовали направления на исследования. Несмотря на то что выбраковка по причине гемолиза определена на этапе взятия крови и первичной пробоподготовки, в лабораторию в 0,31 % случаев доставляются гемолизированные образцы. В 0,5–1 % случаев в пробах сыворотки встречаются нити фибрина, сгустки, осадок эритроцитов. Регистрируются случаи доставки количества сыворотки, недостаточного для выполнения назначенных тестов. Такие несоответствия являлись результатом неполного соблюдения поликлиниками правил пробоподготовки: выдержки необходимого времени сворачивания крови, соблюдения режима центрифугирования крови и пипетирования сыворотки.

Для образцов сыворотки с выявленными ошибками транскрипции тестов лаборатория выясняет необходимую информацию по телефону, после чего образцы, как правило, принимаются в работу. Указанные действия позволили минимизировать потери образцов по причине нарушений правил преаналитики. Выбраковка с оформлением акта отказа в приеме биологического материала с объяснением причин проводится для гемолизированных образцов либо для случаев, когда доставляется только проба сыворотки без направления и наоборот. Пробы сыворотки со сгустками, эритроцитами подвергаются повторному центрифугированию, после чего выполняются исследования.

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.